Nội dung Text: Biến đổi nồng độ DNA phôi thai tự do ở các thai phụ tuổi thai từ 6 đến 15 tuần
HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 hiệu quả của liệu pháp điều trị trúng đích ở 2011;29(15):2011-2019. bệnh nhân UTĐTT người Việt Nam. doi:10.1200/JCO.2010.33.5091 5. Bùi Ánh Tuyết. Nghiên cứu một số đặc điểm TÀI LIỆU THAM KHẢO lâm sàng, cận lâm sàng và tình trạng đột biến 1. IARC. Globocan 2020, Colorectal Cancer. gen KRAS trong ung thư đại trực tràng tại https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancer Bệnh viện K. Luận án tiến sĩ. Trường Đại học s/10_8_9-Colorectum-fact-sheet.pdf Y Hà Nội. 2018. 2. IARC. Globocan 2020, Viet Nam. 6. Nguyễn Kiến Dụ. Nghiên cứu đặc điểm lâm https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/popula sàng, cận lâm sàng và đột biến gen KRAS, tions/704-viet-nam-fact-sheets.pdf BRAF ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng. 3. Berg M, Soreide K. EGFR and downstream Luận án tiến sĩ. Trường Đại học Y Hà Nội. genetic alterations in KRAS/BRAF and 2017. PI3K/AKT pathways in colorectal cancer: 7. Lê Thái Khương, Nguyễn Đại Dương, Đỗ implications for targeted therapy. Discov Đức Minh, Hoàng Anh Vũ. Khảo sát đột Med. 2012;14(76):207-214. biến các gen KRAS, NRAS, BRAF và 4. Van Cutsem E, Köhne CH, Láng I, et al. PIK3CA trong ung thư đại trực tràng bằng kỹ Cetuximab plus irinotecan, fluorouracil, and thuật giải trình tự gen thế hệ mới. Tạp chí Y leucovorin as first-line treatment for Học TP Hồ Chí Minh. 2021;25(6):191-197. metastatic colorectal cancer: updated analysis 8. Bộ Y tế. Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị ung of overall survival according to tumor KRAS thư đại - trực tràng. Quyết định số 2549/QĐ- and BRAF mutation status. J Clin Oncol. BYT. 19/04/2018. BIẾN ĐỔI NỒNG ĐỘ DNA PHÔI THAI TỰ DO Ở CÁC THAI PHỤ TUỔI THAI TỪ 6 ĐẾN 15 TUẦN Vũ Thảo Hằng2, Đặng Tiến Trường2, Nguyễn Duy Bắc2, Nguyễn Xuân Kiên2 TÓM TẮT 32 lấn (NIPT) ở tuổi thai sớm. Đối tượng và Mục tiêu: Khảo sát tỷ lệ DNA phôi thai tự do phương pháp nghiên cứu: DNA tự do được ở giai đoạn trước 10 tuần là cơ sở cho việc triển tách từ huyết tương thai phụ mang thai nam có khai xét nghiệm sàng lọc trước sinh không xâm tuổi thai từ 6 đến 15 tuần của thai kỳ. Định lượng DNA tự do bằng kỹ thuật Realtime PCR. Xác 1 Bệnh viện Quân y 103 định tỷ lệ nồng độ DNA phôi thai tự do ở thai 2 Học viện Quân y phụ tuổi thai 6 đến 15 tuần. Kết luận: Nồng độ Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Xuân Kiên và tỷ lệ phần trăm DNA phôi thai tự do trong Email: xuankiễn@yahoo.com huyết tương thai phụ từ 6 đến 15 tuần có xu Ngày nhận bài: 29/7/2022 hướng tăng dần theo tuổi thai. Ngày phản biện khoa học: 16/08/2022 Từ khóa: cfDNA, NIPT và tuổi thai. Ngày duyệt bài: 05/09/2022 228
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG 9 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 SUMMARY thai kỳ và không tìm thấy trong máu mẹ sau CHANGE OF CELL-FREE FETAL DNA khi sinh. Vì vậy, cffDNA được coi là dấu ấn CONCENTRATION IN MATERNAL sinh học đầy hứa hẹn trong chẩn đoán trước PLASMA AT 6-15 WEEKS OF sinh không xâm lấn từ giai đoạn sớm của thai GESTATION kỳ. Objective: Surveying fetal fraction (FF) Xét nghiệm sàng lọc trước sinh không before 16 weeks of gestation is the basis for xâm lấn (NIPT) phân tích DNA phôi thai tự performing non-invasive prenatal screening do (cffDNA) trong máu ngoại vi của người testing (NIPT) at early gestational age. Materials mẹ giúp phát hiện sớm các hội chứng liên and methods: Cell-free DNA (cfDNA) was quan đến bất thường về số lượng NST ở thai isolated from the plasma samples of the pregnant nhi với độ chính xác cao, quy trình thu mẫu women with male fetus were at 6 to 15 weeks of đơn giản, an toàn cho mẹ và thai nhi. Nhờ kỹ gestation. Cell-free fetal DNA (cffDNA) and thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS), kết hợp cfDNA concentration were quantified by Real- với phân tích tin sinh giúp phân tích các time PCR and then used for the determination of cffDNA, việc sàng lọc và đánh giá khả năng FF. Results: cffDNA concentration in maternal thai nhi mắc các rối loạn liên quan đến các plasma and FF increased with gestational age bất thường số lượng nhiễm sắc thể với hàm from 6 to 15 weeks. lượng cffDNA của thai nhi rất thấp. NIPT Keywords: cfDNA, NIPT, and gestational sàng lọc và phát hiện di tật thai nhi từ rất age. sớm giúp bác sỹ đưa ra các phương pháp chẩn đoán cũng như can thiệp kịp thời, tối ưu I. ĐẶT VẤN ĐỀ cho mẹ và thai nhi thay vì phải thực hiện các Trong máu của thai phụ, ngoài cfDNA phương pháp xâm lấn khác ảnh hưởng đến của người phụ nữ còn có một lượng nhỏ sức khỏe của thai phụ và thai nhi… DNA tự do của thai nhi được gọi là cell-free Để kết quả NIPT đáng tin cậy, tỷ lệ phần fetal DNA (cffDNA) lưu hình trong hệ tuần trăm cffDNA có nguồn gốc từ thai nhi và huần của thai phụ [21]. cffDNA có nguồn cfDNAtrong huyết tương của người mẹ,được gốc chủ yếu từ những tế bào gai nhau chết gọi là tỷ lệ DNA phôi thai thai tự do ( fetal theo chu trình của tế bào [3, 25]; có thể phát faction- ff) phải đủ lớn để tránh kết quả âm hiện sớm nhất vào tuần thứ 4 của thai kỳ [13] tính giả hoặc xét nghiệm thất bại dẫn đến và bị đào thải hoàn toàn sau khi sinh trong phải thu mẫu, xét nghiệm lại. Hầu hết các kỹ vòng 24 đến 48 giờ [16, 27]. Lượng cffDNA thuật NIPT yêu cầu tỷ lệ này trên 4% [4] và chỉ chiếm 0,1 – 46,1% trong tổng số DNA tự thường được thực hiện sau tuần thứ 10 của do trong máu của người mẹ [9] và hàm thai kỳ. Tuy nhiên, các cải tiến kỹ thuật gần lượng cffDNA sẽ tăng theo các giai đoạn đây giúp làm giàu DNA phôi thai tự do trong phát triển của thai nhi [15]. Không giống với mẫu giải trình tự giúp cải thiện độ độ nhạy DNA của tế bào, DNA phôi thai tự do chủ của NIPT nên có tiềm năng giúp thực hiện yếu gồm các đoạn DNA nhỏ, có kích thước kỹ thuật này ở tuổi thai sớm hơn [20].. dưới 193 bp và ngắn hơn DNA tự do có Các nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật PCR, nguồn gốc từ mẹ [5]. DNA phôi thai tự do nested PCR, RFLP, Realtime PCR, để phát với ưu điểm xuất hiện sớm, tồn tại trong suốt hiện DNA phôi thai tự do lưu hành trong 229
HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 tuần hoàn mẹ. Trên thế giới đã có nhiều Mẫu DNA huyết tương được sử dụng để nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật Realtime thực hiện kỹ thuật Realtime PCR định lượng PCR thực hiện gen SRY để định lượng DNA gen SRY và gen HBB (là marker đặc hiệu phôi thai tự do từ tuần thứ 5 của thai kỳ và cho DNA tự do tổng số trong huyết tương. gen HBB như marker đại diện cho DNA tổng Trình tự mồi và probe của gen SRY: số trong huyết tương thai phụ [6, 11, 15]. SRY-F: 5’- Nhiều nghiên cứu sử dụng nhiều thuật toán TCCTCAAAAGAAACCGTGCAT-3’; khác nhau để tính toán FF (SeqFF, SRY-R: 5’- FetalQuant, DEFRAG, DANSRTM, ...) chỉ ra AGATTAATGGTTGCTAAGGACTGGAT- FF tăng dần theo tuổi thai tuổi thai sớm (6- 3’; SRY-P: 5’- (FAM) 15 tuần tuổi) [10, 12, 14, 17-19, 22-24, CACCAGCAGTAACTCCCCACAACCTC 26].Tuy nhiên, kết quả khảo sát nồng độ TTT (TAMRA)-3’. Trình tự mồi và probe cffDNA trước 10 tuần còn hạn chế và nhiều của gen HBB: HBB-F: 5’- mâu thuẫn. Khảo sát tỷ lệ DNA phôi thai tự GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3’; do ở giai đoạn trước 10 tuần là cơ sở cho HBB-R: 5’- việc triển khai NIPT ở tuổi thai sớm hơn. CCTTGATACAACCTGCCCAG-3’. HBB- P: 5’-(FAM) II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG 2.1. Đối tượng (TAMRA)-3’ [9]. 50 thai phụ, được theo dõi và khẳng định Thực hiện phản ứng PCR đơn mồi (từng mang thai nam có tuổi thai từ tuần thứ 6 đến cặp primer và probe riêng lẻ) để định lượng tuần thứ 15 của thai kỳ tham gia chương DNA thai nhi tự do bằng Realtime PCR. Thể trình sàng lọc bệnh di truyền liên kết nhiễm tích phản ứng là 25µl,s gồm: Quantitect sắc thể X và sàng lọc lệch bội nhiễm sắc thể probe PCR mastermix 1X; 2,5µM primer mỗi loại; 1,25µM probe; DNA template, mẫu không xâm lấn tại Học viện Quân y và Bệnh chuẩn đã được pha loãng ở các nồng độ từ viện Phụ sản Hà Nội. 106 đến 102 bản sao/ml hoặc nước làm đối 2.2. Phương pháp chứng âm vừa đủ. Điều kiện của phản ứng Tách huyết tương Realtime PCR được sử dụng theo khuyến Mẫu máu được ly tâm 2 lần để thu huyết cáo của Qiagen. Chu trình nhiệt của phản tương. Bảo quản huyết tương thu được ở - ứng Realtime PCR gồm: biến tính ở 95oC 80◦C cho đến khi sử dụng. trong 15 phút; 50 chu kỳ: 94oC trong 15 Tách cfDNA giây, 60oC trong 1 phút. cfDNA được tách từ 200µl mẫu huyết Đường chuẩn được xây dựng sử dụng tương bằng bộ kit QIAamp® DNA Mini Kit dung dịch DNA đã biết trước nồng độ được (Qiagen, Hilden, Germany) theo hướng dẫn tổng hợp bởi Phusa Bio Chemistry Co. Ltd,. của nhà sản xuất. DNA được bảo quản ở - Tiến hành tính toán nồng độ mẫu chuẩn theo 80◦C cho đến khi sử sụng. định luật Avogadro, pha loãng mẫu chuẩn Định lượng DNA tự do bằng kỹ thuật theo các nồng độ từ 106 đến 102 bản sao/ml. Realtime PCR Nồng độ của gen SRY và gen HBB được biểu diễn theo đơn vị bản sao/ml của huyết tương. 230
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG 9 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 Tính toán nồng độ DNA phôi thai tự do 3.1. Kết quả đường chuẩn của kỹ thuật thông qua số bản sao của SRY (CSRY) và Realtime PCR để định lượng DNA tự do nồng độ DNA tự do tổng số thông qua số bản trong huyết tương thai phụ sao nằm trên gen HBB (CHBB). Xác định chỉ Đường chuẩn được xây dựng từ các mẫu số ff =cffDNA/cfDNA×100%. chuẩn đã được pha loãng liên tiếp, được tiến hành kỹ thuật Realtime PCR bằng máy III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Realtime PCR Rotor-Gene-Q (QIAGEN). Kết quả thu được được trình bày ở hình 1: A. Gen SRY B. Gen HBB Hình 2. Hình ảnh đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR 231
HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 Một phản ứng qPCR tối ưu cần có 3.2. Định lượng nồng độ DNA phôi thai R >0.98 và hiệu quả khuếch đại cao 90- 2 tự do trong huyết tương thai phụ 105%; hơn nữa [11]. Các mẫu chuẩn được Phản ứng Realtime PCR sử dụng cặp mồi pha loãng từ 106-102 copy/ml. Kết quả phân của gen SRY để định lượng số bản sao DNA tích cho thấy đường chuẩn đảm bảo yêu cầu phôi thai tự do có trong mẫu. với R2=0.994, E=103% với gen SRY (Hình Kết quả cho thấy, gen SRY đã phát hiện ở 1A) và R2=0.981, E=102% với gen HBB 37 trên 50 mẫu thai phụ mang thai nam.19 (Hình 1B). Đường chuẩn được thực hiện mẫu không đạt với cặp mồi gen SRY sẽ loại phản ứng cùng với các mẫu cần định lượng, khỏi kết quả nghiên cứu. Kết quả nồng độ các lần thực hiện đều cho tín hiệu tốt với DNA phôi thai tự do của 31 mẫu đạt được R2>0.98 và E = 90-105% để đảm bảo phân tình bày trong bảng 1. tích có độ lặp lại tốt. Bảng 3. Nồng độ DNA phôi thai tự do trung bình ở các tuần thai Nồng độ cffDNA Nồng độ cfDNA Tuổi thai n (bản sao/ml) ( (bản sao/ml) ( Tuần 6 3 14,94±6,47 1.353±205 Tuần 7 3 12,98±2,75 1.360±89 Tuần 8 4 46,36±38,13 1.797±1.053 Tuần 9 3 56,83±18,96 1.757±765 Tuần 10 3 34,32±23.77 860±524 Tuần 11 3 21,88±10,55 485±240 Tuần 12 3 32,80±15,48 853±482 Tuần 13 3 44,67±9,79 1.028±151 Tuần 14 3 71,25±12,31 1.873±948 Tuần 15 3 58,00±7,76 1.550±156 ( 31 39,63±25,64 1.308±707 Nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết hợp với nghiên cứu của Edna D’Souza và tương thai phụ ở các nhóm tuổi thai khác cộng sự (2012)[2, 8]. Nồng độ cffDNA từ nhau là 39,63±25,64 (bản sao/ml) với tuần 11-17 là 25,4 bản sao/ml (Lo và cs, khoảng giá trị 9,18-107,25 (bản sao/ml). 1998). [15]. Bên cạnh đó, báo cáo khác tại Nồng độ cffDNA ở tuần thứ 6 là 14,94 Việt Nam cho thấy nồng độ cffDNA trung (bản sao/ml) và tuần thứ 15 là 58 (bản bình là 574,8 bản sao/ml ở thai phụ từ 12-14 sao/ml). Nồng độ cffDNA phụ thấp nhất ở tuần tuổi [1]. Kết quả ở tuổi thai từ tuần thứ 7 là 12,98 bản sao/ml và cao nhất ở 6,7,8,9,10,11,12 tuần tuổi có nồng độ tuần thứ 14 là 71,25 bản sao/ml; nồng độ này cffDNA tăng dần [8]. có xu hướng tăng dần theo tuổi thai từ 6 đến Nồng độ DNA tự do huyết tương thai phụ 15 tuần. Kết quả của nghiên cứu này phù ở tất cả các nhóm là 1.308±707 (bản sao/ml). 232
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG 9 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 Nồng độ DNA tự do trong huyết tương của 1.873 (bản sao/ml); nồng độ này không có thai phụ trung bình ở các tuần thai từ 6 đến mối liên hệ với tuổi thai ở thai phụ từ 6 đến 15 tuần cho thấy, nồng độ ở tuần thứ 6 là 15 tuần. 1.353 (bản sao/ml) và tuần thứ 15 là 1.550 3.2. Mối tương quan giữa FF và tuổi (bản sao/ml). Nồng độ DNA tự do trong thai huyết tương thai phụ thấp nhất ở tuần thứ 11 Kết quả FF của 31 mẫu nghiên cứu được là 485 (bản sao/ml), cao nhất ở tuần thứ 14 là tình bày trong bảng 2. Bảng 4. Giá trị FF ở các thai phụ ở tuần thai từ 6 đến 15 tuần FF (%) Khoảng dao động (%) Tuổi thai n ( (min – max) Tuần 6 3 2,2±0,9 1,2-3,4 Tuần 7 3 1,9±0,3 1,5-2,2 Tuần 8 4 4,5±1,8 2,7-6,5 Tuần 9 3 7,7±4,2 3,2-11,6 Tuần 10 3 8,0±2,0 5,8-9,6 Tuần 11 3 9,6±2,9 6,3-11,5 Tuần 12 3 8,3±3,5 5,4-12,2 Tuần 13 3 8,9±3,4 6,4-12,8 Tuần 14 3 8,4±2,4 5,8-10,6 Tuần 15 3 7,4±0,6 7,1-8,2 ( 31 6,6±3,4 1,2-12,8 Hình 3. Mối quan hệ giữa tuổi thai và FF 233
HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 Chú thích: Kết quả Bảng 2 và Hình 2 cho thấy FF tuần thai 20, FF tăng tối đa 0,821% mỗi tuần, thấp nhất ở tuần thai thứ 7 là 1,9% (màu FF trung bình ở tuần thai thứ 30 trở đi cam); cao nhất ở tuần thai thứ 11 là 9,6% (≈20%) nhiều hơn gấp đôi với FF trung bình (màu xanh lá). Phân tích hồi quy tuyến tính ở tuần thai thứ 20 (≈9%) [14]. Caroline của biến độc lập cho thấy mối tương quan Borregaard Miltoft và cộng sự (2019), FF thuận giữa FF với tuổi thai từ 6-15 tuần trung bình là 9,3% (7,4-11,4%) ở tuần thai tương đối chặt và có ý nghĩa thống kê 11,3-13; FF tăng 1,2% mỗi tuần trước tuần (R2=0,38, p
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG 9 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 thai), FF trung bình là 10,47% (3,93- của mẹ ở các tuần tuổi thai từ 6 tuần đến 22 31,45%) và ở giai đoạn này FF tăng rất ít và tuần bằng các phương pháp Reatime PCR", Y không có ý nghĩa thống kê [22]. Kết quả về học Việt Nam pp. 138-146. nồng độ cffDNA phôi thai tự do trong huyết 3. Alberry, M, et al. (2007), "Free fetal DNA in tương thai phụ ở nghiên cứu khác nhau giữa maternal plasma in anembryonic pregnancies: confirmation that the origin is the các nghiên cứu. Điều này có thể do phương trophoblast", Prenatal Diagnosis: Published in thức thu huyết tương, kit tách DNA, hiệu Affiliation With the International Society for suất của phản ứng real time PCR và các yếu Prenatal Diagnosis. 27(5), pp. 415-418. tố khác liên quan tới đặc điểm của từng 4. Ashoor, G, et al. (2013), "Fetal fraction in nhóm thai phụ, thai nhi [4, 7, 12, 14, 18]. maternal plasma cell‑free DNA at 11–13 Kết quả nghiên cứu cho thấy, FF ở tuần weeks' gestation: relation to maternal and thai thứ 8 là 4,5% cao hơn giá trị FF thấp fetal characteristics", Ultrasound in Obstetrics nhất để thực hiện kỹ thuật NIPT. Điều này & Gynecology. 41(1), pp. 26-32. cho thấy có thể thực hiện phân tích NIPT từ 5. Chan, KC Allen, et al. (2004), "Size tuần thứ 8 của thai kỳ, sớm hơn 2 tuần so với distributions of maternal and fetal DNA in hiện nay. Điều này có nhiều ý nghĩa trong maternal plasma", Clinical chemistry. 50(1), sàng lọc và chuẩn đoán trước sinh. Hơn nữa, pp. 88-92. những cải tiến của kỹ thuật NIPT trong 6. Costa, Jean‑Marc, et al. (2001), thờitới có càng khẳng địch cho việc xét "First‑trimester fetal sex determination in maternal serum using real‑time PCR", nghiệm NIPT ở tuổi thai sớm hơn, độ chính Prenatal Diagnosis: Published in Affiliation xác cao hơn [20]. With the International Society for Prenatal Diagnosis. 21(12), pp. 1070-1074. V. KẾT LUẬN 7. Curnow, Kirsten J, et al. (2014), "Clinical Nồng độ DNA phôi thai tự do trong huyết experience and follow-up with large scale tương ở thai phụ từ 6 đến 15 tuần có xu single-nucleotide polymorphism–based hướng tăng dần theo tuổi thai. Kết quả noninvasive prenatal aneuploidy testing", nghiên cứu cho thấy FF ở tuần thứ 8 khoảng American journal of obstetrics and 4,5% đạt ngưỡng khuyến cáo áp dụng xét gynecology. 211(5), pp. 527. e1-527. e17. nghiệm sàng lọc trước sinh không xâm lấn ở 8. D’Souza, Edna, et al. (2012), "SRY tuần thứ 8 để sàng lọc một số hội chứng di sequence in maternal plasma: Implications for truyền ở thai nhi. non-invasive prenatal diagnosis: First report from India", Indian journal of human TÀI LIỆU THAM KHẢO genetics. 18(1), p. 87. 9. Davalieva, Katarina, et al. (2006), "Non- 1. Nguyễn Thị Phương Lan (2019), "Nghiên invasive fetal sex determination using real- cứu DNA phôi thai tự do trong huyết tương time PCR", The Journal of Maternal-Fetal & thai phụ bằng kỹ thuật Realtime PCR nhằm Neonatal Medicine. 19(6), pp. 337-342. dự báo sớm tiền sản giật", Luận án Tiến sĩ, 10. Hestand, Matthew S, et al. (2019), "Fetal Đại học Y Hà Nội. fraction evaluation in non-invasive prenatal 2. Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa, and screening (NIPS)", European Journal of Đinh Đoàn Long (2014), "Khảo sát và định Human Genetics. 27(2), pp. 198-202. lượng ADN phôi thai tự do trong huyết tương 235
HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 11. Honda, Hiroshi, et al. (2002), "Fetal gender cohort", Obstetrics and gynecology. 124(2 0 determination in early pregnancy through 1), p. 210. qualitative and quantitative analysis of fetal 20. Qiao, Longwei, et al. (2019), "Sequencing of DNA in maternal serum", Human genetics. short cfDNA fragments in NIPT improves 110(1), pp. 75-79. fetal fraction with higher maternal BMI and 12. Hudecova, Irena, et al. (2014), "Maternal early gestational age", American journal of plasma fetal DNA fractions in pregnancies translational research. 11(7), p. 4450. with low and high risks for fetal chromosomal 21. Sekizawa, Akihiko, et al. (2000), "Apoptosis aneuploidies", PloS one. 9(2), p. e88484. in fetal nucleated erythrocytes circulating in 13. Illanes, S, et al. (2007), "Early detection of cell- maternal blood", Prenatal diagnosis. 20(11), free fetal DNA in maternal plasma", Early pp. 886-889. human development. 83(9), pp. 563-566. 22. Shi, Xiaolin, et al. (2015), "Feasibility of 14. Kinnings, Sarah L, et al. (2015), "Factors noninvasive prenatal testing for common fetal affecting levels of circulating cell‑free fetal aneuploidies in an early gestational window", DNA in maternal plasma and their Clinica Chimica Acta. 439, pp. 24-28. implications for noninvasive prenatal testing", 23. Song, Y, et al. (2015), "Non‑invasive prenatal Prenatal Diagnosis. 35(8), pp. 816-822. testing for fetal aneuploidies in the first 15. Lo, YM Dennis, et al. (1998), "Quantitative trimester of pregnancy", Ultrasound in analysis of fetal DNA in maternal plasma and Obstetrics & Gynecology. 45(1), pp. 55-60. serum: implications for noninvasive prenatal 24. Suzumori, Nobuhiro, et al. (2016), "Fetal diagnosis", The American Journal of Human cell-free DNA fraction in maternal plasma is Genetics. 62(4), pp. 768-775. affected by fetal trisomy", Journal of human 16. Lo, YM Dennis, et al. (1999), "Rapid genetics. 61(7), pp. 647-652. clearance of fetal DNA from maternal 25. Tjoa, May Lee, et al. (2006), "Trophoblastic plasma", The American Journal of Human oxidative stress and the release of cell-free Genetics. 64(1), pp. 218-224. feto-placental DNA", The American journal 17. Miltoft, Caroline Borregaard, et al. (2020), of pathology. 169(2), pp. 400-404. "Cell-free fetal DNA in the early and late first 26. Wang, Eric, et al. (2013), "Gestational age trimester", Fetal diagnosis and therapy. 47(3), and maternal weight effects on fetal cell‑free pp. 228-236. DNA in maternal plasma", Prenatal diagnosis. 18. Norton, Mary E, et al. (2012), "Non- 33(7), pp. 662-666. Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) 27. Yu, Stephanie CY, et al. (2013), "High- Study: results of a multicenter prospective resolution profiling of fetal DNA clearance cohort study for detection of fetal trisomy 21 from maternal plasma by massively parallel and trisomy 18", American journal of sequencing", Clinical chemistry. 59(8), pp. obstetrics and gynecology. 207(2), pp. 137. 1228-1237. e1-137. e8. 28. Zhou, Yi, et al. (2015), "Effects of maternal 19. Pergament, Eugene, et al. (2014), "Single- and fetal characteristics on cell-free fetal DNA nucleotide polymorphism–based noninvasive fraction in maternal plasma", Reproductive prenatal screening in a high-risk and low-risk Sciences. 22(11), pp. 1429-1435. 236